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微流控芯片在牙周領(lǐng)域中的應(yīng)用及展望
牙周病是一種由微生物引起的慢性炎癥性疾病，不僅可能導(dǎo)致牙齒脫落，還可能導(dǎo)致全身性疾病的發(fā)生，如阿爾茨海默癥、心血管疾病、糖尿病等。及時診斷早期牙周病，并對其加以控制和治療，對口腔乃至全身健康具有重要的意義。本文從微流控芯片相關(guān)概念和技術(shù)出發(fā)，對該裝置在牙周病的診斷與治療中的應(yīng)用情況做一綜述，并展望其未來在牙周領(lǐng)域可能發(fā)揮重要作用的方向，為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供試驗思路與參考。
1.微流控芯片實驗室概述
微流控芯片（microfluidics）又稱芯片實驗室（lab-on-achip，LOC），是以分析生物和化學(xué)為研究對象，將該領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米的封裝芯片上，形成微通道網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以替代常規(guī)生化實驗室各種功能的一種裝置，它的基本特征和最大優(yōu)勢是多種單元技術(shù)在微小平臺上的靈活組合和大規(guī)模集成，能夠以更高的靈敏度快速檢測分析物。
目前微流控芯片主要應(yīng)用于感染性疾病的即時檢測（point-of-care testing， POCT）、腦神經(jīng)研究、早期癌癥篩查及血管性疾病治療等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近年來，隨著技術(shù)不斷地發(fā)展并趨于成熟，研究者將目光聚焦于微流控芯片在牙周領(lǐng)域中的應(yīng)用，并逐漸成為新的研究熱點，下面將逐一介紹微流控芯片在牙周病診斷與治療中的應(yīng)用前景。
2.微流控芯片與牙周病POCT診斷
即時檢測（point of care testing，POCT）是一種能在患者床旁、病房或者傳統(tǒng)實驗室之外的地方進(jìn)行的快速檢測分析技術(shù)，它可以在采樣現(xiàn)場即刻進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)實驗室檢測相比，POCT在臨床檢測中具有操作簡單化、標(biāo)本用量少、成本低、耗時較短等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療和病情監(jiān)測。
牙周治療的首要目標(biāo)應(yīng)是早期診斷和干預(yù)。然而，目前臨床上的牙周診斷技術(shù)缺乏識別牙周病進(jìn)展高風(fēng)險患者的能力，且難以監(jiān)測病變的微小轉(zhuǎn)變，因此需要開發(fā)牙周病診斷的新方法。
近年來，研究人員在改進(jìn)原有的診斷技術(shù)及發(fā)展新技術(shù)方面進(jìn)行了大量的探索，牙周病的診斷方法正向敏感、精確、快速的方向發(fā)展，如POCT 定量檢測。相比于傳統(tǒng)的牙周探查，POCT定量檢測有其獨特的優(yōu)勢：（1）檢測樣本多為唾液，可以由醫(yī)學(xué)或非醫(yī)學(xué)人員隨時收集樣本，安全無創(chuàng)；（2）樣本量需求少；（3）多路檢測；（4）便攜、操作簡單且快速；（5）成本低，可用于廣泛篩查、診斷和監(jiān)測。
由于微流控芯片微型化、集成化、自動化的特性高度契合POCT檢測技術(shù)的發(fā)展需求，采用微流控芯片進(jìn)行牙周病的POCT診斷近年來已日趨成為POCT領(lǐng)域的研究熱點。
2.1 POCT芯片快速檢測牙周致病菌
以往的研究顯示某些細(xì)菌是重度牙周炎易感性的有力指標(biāo)，即病原菌在唾液中的水平可以用于評估牙周病的活動性以及預(yù)測其進(jìn)展，因此檢測唾液中的牙周致病菌是一種潛在的牙周病診斷方式。然而，傳統(tǒng)牙周致病菌基因定量檢測主要采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qPCR），但該方法耗費成本高、檢測速度慢。
為解決這些問題，有學(xué)者嘗試將傳統(tǒng)的牙周致病菌分離鑒定技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合以快速、準(zhǔn)確地檢測牙周病原菌，并通過一系列研究探索牙周病臨床診斷的新方法。目前比較公認(rèn)的牙周可疑致病菌包括牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis， P.gingivalis）、齒垢密螺旋體（Treponema denticola， T.denticola）、福賽斯坦納菌（Tannerelaforsythia， T.forsythia）等。
Li等在受試者上中切牙的牙周袋內(nèi)收集齦溝液，并基于集成的連續(xù)流聚合酶鏈反應(yīng)（continuous flow polymerase chain reaction， CF-PCR）和電泳生物芯片，制作了一種便攜式一體化微流控設(shè)備，可快速診斷齦溝液內(nèi)的牙周病原體。裝置不僅實現(xiàn)了P.gingivalis、T.denticola以及T.forsythia DNA的快速擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的現(xiàn)場定量檢測，而且實現(xiàn)了樣品的自動注射。該裝置僅用2分31秒成功擴(kuò)增T.denticola，3分43秒內(nèi)完成PCR產(chǎn)物的檢測。
此外該裝置的標(biāo)本用量少，可檢測的最小細(xì)菌菌落數(shù)為125 CFU/μL。該實驗證明了CF-PCR 微流控芯片具有應(yīng)用于現(xiàn)場核酸檢測以診斷牙周病的潛力，促進(jìn)病原體診斷和基因研究的發(fā)展，未來有望將CF-PCR芯片轉(zhuǎn)化至臨床應(yīng)用。
2.2 POCT芯片快速檢測牙周病生物標(biāo)志物
以往研究認(rèn)為生物體液中的炎癥介質(zhì)水平是判斷牙周組織炎癥活動的良好指標(biāo)，牙周病患者口腔中的唾液含有牙周病誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，這表明唾液檢測具有評估牙周病患者炎癥狀況和風(fēng)險以及作為牙周病診斷方式的潛力。以往檢測蛋白質(zhì)表達(dá)最可靠和常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）， 但該方法存在樣本和試劑反應(yīng)時間長、操作技術(shù)難度大以及設(shè)備昂貴等問題。
Herr等設(shè)計并開發(fā)了一個用于口腔診斷的集成微流控平臺（integrated microfluidic platform for oral diagnostics，IMPOD），該平臺可用于對唾液樣本進(jìn)行即時、快速的分析。此外，該研究團(tuán)隊在另一項研究中將唾液樣品預(yù)處理與電泳免疫分析相結(jié)合，耗時僅10 min便可測量經(jīng)最低限度預(yù)處理的唾液樣品中分析物的濃度。
MMP-8被認(rèn)為是牙周病主要的組織破壞酶，研究人員采用POCT 芯片與ELISA 法分別檢測了健康人與牙周病患者唾液中MMP-8的水平，結(jié)果顯示兩種方法測量出的MMP-8水平具有一致性，健康人的MMP-8水平顯著低于牙周病患者且牙周病患者中MMP-8的水平與牙周病破壞的程度具有線性相關(guān)性。該結(jié)果支持MMP-8可能與牙周病活動有關(guān)，是判斷牙周病嚴(yán)重程度較理想的生化指標(biāo)。
唾液中有一種由內(nèi)皮非合成酶釋放的一氧化氮產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)——亞硝酸鹽，其濃度與牙周組織的臨床癥狀呈負(fù)相關(guān)，可以作為牙周病進(jìn)展的一個指標(biāo)。亞硝酸鹽的定量分析有許多種方法，其中分光光度法在簡單性、儀器需求、成本和靈敏度之間提供了一個適當(dāng)?shù)钠胶�，雖然該方法已被廣泛使用，但缺點是需要分光光度計、較多的試劑及大樣本量。Bhakta等設(shè)計并制造出一種微流體紙基分析設(shè)備，該裝置可以幫助建立唾液亞硝酸鹽水平和牙周炎之間的關(guān)系。最終結(jié)果顯示微流體紙基分析設(shè)備可以準(zhǔn)確地測量出受試者唾液中亞硝酸鹽的濃度范圍并與傳統(tǒng)分光光度計測量結(jié)果呈線性關(guān)系。
3.微流控芯片與牙周病相關(guān)治療研究
牙周病的治療關(guān)鍵是控制菌斑、消除炎癥。目前的治療方法主要包括基礎(chǔ)治療、藥物治療、手術(shù)治療以及新技術(shù)應(yīng)用等。近年來，微流控芯片應(yīng)用于牙周抗菌治療，特別是對菌斑生物膜的影響研究較多。為了更好地了解生物膜的發(fā)生發(fā)展特性，Brann等設(shè)計并制造了一個微流控可視化芯片，并利用該新型成像芯片和白光干涉術(shù)（white-light interferometry，WLI）監(jiān)測齦下菌斑生物膜結(jié)構(gòu)的變化。WLI成像原理是依靠邁克爾遜式白光干涉成像系統(tǒng)的干涉物鏡能夠收集數(shù)據(jù)，用于構(gòu)建樣本表面的三維輪廓。
Brann等人的研究顯示，采用該芯片所成圖像可以展現(xiàn)菌斑生物膜在不同時間的發(fā)展情況，結(jié)果顯示菌斑生物膜的發(fā)展是從獨立的小菌斑逐漸發(fā)展、融合為大的菌斑且菌斑厚度也隨著時間的推移而增加。WLI成像有助于監(jiān)測生物膜發(fā)育的早期階段和成熟生物膜結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化。
未來，WLI和微流控芯片可能用于測試生物膜特異性治療的有效性，以對抗與生物膜形成相關(guān)的牙周疾病。Belibasakis等利用微流控芯片技術(shù)探究齦下菌斑生物膜對牙齦上皮細(xì)胞間連接相關(guān)的62個基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示齦下菌斑生物膜對緊密連接、貼壁連接和縫隙連接的表達(dá)影響有限，但對上皮細(xì)胞間橋體成分的基因表達(dá)有較大影響。該研究不僅證實了齦下菌斑生物膜可以下調(diào)牙齦上皮細(xì)胞間的橋粒連接，損害牙齦組織的結(jié)構(gòu)完整性，有利于細(xì)菌入侵和慢性感染，還證明了微流控芯片未來可以應(yīng)用于齦下菌斑生物膜模型相關(guān)的各種研究，如基因表達(dá)等。
隨著基因組計劃的快速發(fā)展，基因芯片與高通量測序技術(shù)在全基因組和轉(zhuǎn)錄組的測序、疾病的基因?qū)用鏅C(jī)理探究等方面應(yīng)用廣泛，雖然新興技術(shù)拓展了樣本量檢測下限，并具有多樣性、并行性、自動化等優(yōu)點，但現(xiàn)有技術(shù)仍存在不足之處。基因芯片是針對已知微生物設(shè)計的寡核苷酸探針，并不能檢測未知微生物，且目前基因芯片采用定性半定量的快速檢測方法，對于需要定量檢測的微生物仍需借助實時熒光定量PCR技術(shù)才能實現(xiàn)；高通量測序技術(shù)在測序覆蓋度、均一性、可重復(fù)性、精確性等方面存在一定的缺陷，同時還存在成本昂貴、運行時間較長等問題。
相比于前述方法，微流控芯片集成度高、準(zhǔn)確度好、試劑消耗低、反應(yīng)速度快，目前已有相關(guān)研究通過微流控裝置進(jìn)行人牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的單細(xì)胞RNA 測序分析、評價腫瘤藥物療效、轉(zhuǎn)染mRNA、高通量篩選、檢測多種腫瘤生物標(biāo)志物以及基因的表達(dá)情況等。未來微流控芯片有望通過與單細(xì)胞測序等新興技術(shù)聯(lián)合，代替?zhèn)鹘y(tǒng)生物實驗室操作，幫助科研人員更簡便更準(zhǔn)確地完成試驗。
4.展望
微流控芯片由于其集成度高、準(zhǔn)確度好、試劑消耗低、反應(yīng)速度快等優(yōu)勢，成為構(gòu)建多種疾病預(yù)防、診斷及治療系統(tǒng)的核心裝置。它不僅可以同時檢測并分析唾液中的多種生物標(biāo)志物，還提高了測試的靈敏度和特異性，有望推向臨床，成為正式的牙周病診斷新方法。此外，微流控芯片快速集成的優(yōu)勢有望幫助其取代傳統(tǒng)的生化試驗室，成為基礎(chǔ)研究實驗的新模式，同時隨著微加工技術(shù)的迅速發(fā)展，其有望提供一體化的復(fù)雜檢測和診斷功能。
當(dāng)前，各種技術(shù)，發(fā)展迅速，人工智能為口腔生物標(biāo)志物識別技術(shù)提供了新的思路。然而，微流控芯片在牙周病防治方面的應(yīng)用研究仍然不夠深入與全面，需要研究者對此進(jìn)行深入探索與研究。未來，隨著芯片技術(shù)的發(fā)展和檢測手段的提高，微流控芯片在牙周疾病領(lǐng)域應(yīng)用的深度和廣度上將會有更大的提高，有望覆蓋口腔乃至醫(yī)療行業(yè)的各個領(lǐng)域。
